Las macromoléculas biológicas son un pre requisito para todas las formas de vida. Sus pesos moleculares oscilan entre 10⁴ y 10⁶, y están formadas principalmente por C, N, O, H, P y S. Sólo un miembro de este grupo de macromoléculas, y más precisamente, el ADN, por su estructura ordenada, puede ser capaz de conducir la información genética que determina a su vez, la secuencia de ámino ácidos de las proteínas y por lo tanto las características específicas de cada especie. La secuencia de las subunidades componentes, (Monómeros), organizadas en estas moléculas grandes, es responsable de la transmisión de la información genética, de las funciones de las células, proporcionan además los mecanismos de regulación de la estructura espacial en condiciones naturales, es decir, en un rango de concentraciones de pH de 6.5-7.7, temperaturas entre 10 y 40ºC, concentraciones iónicas débiles, 760 mbares de presión, con las excepciones correspondientes. La función de estas macromoléculas es claramente dependiente de y determinada por la formación de una única y correcta organización espacial. Por esta razón, resulta imprescindible en la actualidad, conocer la estructura de estas biomoléculas, las fluctuaciones que les son permitidas para realizar su función y la fuerte dependencia de estas fluctuaciones con los factores ambientales, es decir, su comportamiento tanto en solución, como en interacción estrecha con otras moléculas de los sistemas vivientes como de su entorno.

La síntesis de estas macromoléculas en los sistemas biológicos corresponde a la condensación de subunidades (monómeros), de pesos moleculares pequeños. Pueden reconocerse dos clases principales, dependiendo de sus características globales:

Figura 2.2. Dos moléculas de -1, 4 D-glucosa unidas por un enlace glicosídico.

Anexo 2.1.

Tipos de azúcares y de uniones en polisacáridos

Constituidos por más de un tipo de monosacáridos, por ejemplo aquellos constituidos por dos monosacáridos en secuencia alternante

Acido hialurónico : componente del cemento celular en el tejido conectivo.

(Acido D-glucurónico-N-acetil-D-glucosamina)

(Acido D-glucurónico-N-acetil-galactosamina)

Muchos de los carbohidratos se encuentran asociados a proteínas para efectuar su función, así podemos encontrarlos en las secreciones celulares como el mucopolisacárido que contiene una mezcla de carbohidratos como el condroitin sulfato o la Heparina que posee propiedades anticoagulantes y que contiene unidades disacáridas [(-ácido urónico(1-4)-GlcN-2, 6 disulfato-(1-4)]n.

Los carbohidratos también se encuentran formando parte de glicoproteínas, de membranas proporcionando a las proteínas una aun mayor diversidad a causa de los monómeros particulares, en general a través de enlaces del tipo O-glicosídicos unidos a través de residuos de treonina y serina o por uniones N-glicosídicas a través de asparragina y glutamina. Los carbohidratos pueden considerarse como monómeros polares y por lo tanto se encuentran generalmente expuestos al solvente(agua) e interaccionando con él.

Los ácidos nucleicos, ADN y ARN son polinucleótidos. La estructura básica de repetición son los nucleótidos. Cada nucleótido está formado por una base púrica o pirimidínica, un azúcar(D-ribosa o D-2-desoxiribosa) y por el ácido fosfórico. Esta estructura está representada en la Figura 2.5.

Los nucleótidos se unen por eliminación de una molécula de agua como se indica en la figura 2.6.

A los heterociclos purinas y pirimidinas que se encuentran en los ácidos nucleicos, se les conoce en general como bases (ver Figura 2.7), aunque no son específicamente básicos. Los nucleósidos son los N-glicosil derivados de las bases con D-ribosa o D-2-desoxiribosa. Los nucleótidos son los ésteres fosfato de los nucleósidos.

De acuerdo a lo destacado en la figura, las bases nitrogenadas son planares y pueden encontrarse como keto o ámino tautómeros. Los grupos ámino son coplanares con los héterociclos debido a la resonancia electrónica.

Figura 2.8. Estructura de ribosa y desoxiribosa.

El anillo furanosa de la ribosa y de la desoxiribosa no son planares y pueden existir en diferentes conformaciones. Generalmente es el C-2' o el C-3' el que está fuera del plano de los otros cuatro átomos del anillo. Si este carbono está por encima del anillo se denomina endo; si está por debajo se denomina exo. La conformación C-2' endo y la C-3' endo parecen ser las más comunes en los nucleótidos sin polimerizar. En cualquiera de los dos casos puede encontrarse las conformaciones tipo N (north) o S (south) que corresponden al esquema que se muestra en la Figura 2.9

Las conformaciones más comunes

para una hexosa como la glucosa

se esquematizan en el esquema

adjunto y se muestran además

los equilibrios correspondientes.

Figura 2.10. Estructura de un nucleótido.

Se define la conformación anti (127º), en que el CO y el NH en las posiciones 2 y 3 del anillo pirimidínico (o en las posiciones 1, 2 y 6 del anillo de purina) se alejan del azúcar, y la conformación syn, (con una diferencia de 180º), en que estos grupos se encuentran sobre el anillo. En general, para describir con detalle la conformación de un polinucleótido se requiere conocer otros ángulos que relacionan las diferentes partes de la molécula.

Son las características de las subunidades monoméricas, en que algunos de sus componentes son planares y que presentan grupos cargados negativamente como el fosfato, las que permiten al polímero adoptar varios tipos de conformaciones, así como interaccionar con otras moléculas del medio.

Una cadena polinucleotídica puede representarse abreviadamente por convención de la siguiente manera:

5'G G C U U U A C3'

5'GpGpCpUpUpUpApC3'

que corresponde a los nucleótidos Guanosina, Guanosina, Citosina, tres nucleótidos de Uracilo, Adenosina y Citosina, escritos desde el extremo 5' hasta el 3'. Esto último indica la numeración correspondiente a los átomos de carbono en la ribosa.

En la investigación sobre la estructura de los ácidos nucleicos, se han utilizado técnicas como la cristalografía por difracción de rayos X. El método convencional de cristal único se utiliza para el estudio de mono y oligo nucleótidos. Para el t-ARN (ARN de transferencia), que tiene una estructura globular, se utiliza los métodos aplicados a la cristalografía de proteínas. ADN y ARN polimérico no forman cristales, sólo pueden obtenerse fibras cuasicristalinas debido al desorden propio de las estructuras fibrilares, y por lo tanto la información que puede obtenerse de la cristalografía es mucho menor. Así, ha sido posible proponer modelos estructurales basados en el conocimiento estereoquímico de las unidades pequeñas utilizando además, cálculos de energía potencial. Entre los métodos espectroscópicos, la Resonancia Magnética Nuclear es la metodología que ha aportado una mayor cantidad de información sobre la conformación de mono y oligonucleótidos en solución, Estos datos combinados con la información cristalográfica y los cálculos teóricos producen un modelo coherente con los datos experimentales.

El ADN es una molécula extremadamente larga y delgada. La hebra de ADN que constituye el genoma del Escherichia coli tiene 1.1 mm de longitud y corresponde a un peso molecular de 2.8x10⁹. Está compuesto de nucleótidos enlazados por uniones fosfodiester, tal como lo hemos descrito. Estos nucleótidos contienen 4 distintos tipos de bases; estas son Guanina (G), Citosina (C), Adenina (A) y Timina (T). El modelo que hoy tenemos del ADN, está basado en el descubrimiento de Watson y Crick que se publicó en 1953, en el que proponen al ADN como una doble hélice de dos cadenas polinucleotídicas antiparalelas y complementarias, en que el apareamiento de las bases se realizaba a través de uniones puente H. Existen dos modelos de apareamiento de las bases nucleotídicas (Watson y Crick y el modelo de Hoogsteen). En la Figura 2.11 se muestra el modelo de Watson y Crick para el apareamiento de las bases indicando sus dimensiones. En esta figura es posible observar que las dimensiones de las uniones puente hidrógeno no son idénticas, indicando la "flexibilidad" del enlace y del efecto que las propiedades de la vecindad atómica tiene sobre la fuerza de este tipo de interacciones:

Anexo 2.2.

Los sistemas heterocíclicos en los nucleósidos son susceptibles de sufrir tautomerismo; dependiendo de cuál sea el tautómero presente, así serán el tipo y número de uniones puente hidrógeno que podrán formarse. Esto se indica en detalle en la figura que indica el tautomerismo Ceto-Enol y Amino-Imino en bases nucleotídicas. Puede observarse que en la forma enólica, G se hace equivalente a A y U equivalente a C. En la forma imino A es equivalente a U o G y C es equivalente a A. En condiciones fisiológicas sin embargo, más del 99.99% corresponde a la forma Ceto o amino, lo cual favorece la función del ADN.

La protonación o deprotonación de las bases ocurre entre pH 3.5 y 10.5; esto hace que el pH sea un componente decisivo en el tautomerismo de estas bases. Algunos valores de pKa para las bases nucleotídicas se muestran en la siguiente tabla:

Tabla de pK

Este tipo de apareamiento ocurre solamente si A se aparea con T y C con G(ver figura 2.12). De este modo una de las cadenas es complementaria pero no idéntica a la otra. La secuencia de bases en el ADN deriva de un patrón genético para cada especie. El ADN puede adoptar varias conformaciones dependiendo de las condiciones ambientales como presencia de contraiones, humedad relativa, secuencia y composición nucleotídica. La Figura 2.13 muestra el modelo más difundido de la doble hélice del ADN, el B-DNA, indicándose la nomenclatura usual para denominar diferentes aspectos de la molécula.

El modelo establece que se trata de una doble hélice antiparalela hacia la derecha. Presenta dos curvaturas, denominadas hendidura mayor y hendidura menor de acuerdo a su tamaño. Los grupos fosfato quedan hacia la periferia por lo tanto son susceptibles a la interacción con iones. Cuando la doble hélice está formada su estabilidad es muy alta y son necesarios grandes cambios en el solvente para producir alteraciones en su estructura, durante su formación en cambio la presencia del solvente resulta muy importante. La superficie que expone el ADN resulta fundamental en la interacción con otras moléculas ya que le permite ejecutar su función.

De acuerdo a los modelos propuestos en base a los estudios de difracción de rayos X de fibras de ADN se pueden diferenciar doble hélices a la derecha : A-ADN, B-ADN y T-ADN; y Z-ADN que es una doble hélice a la izquierda. Las características estructurales de cada uno de estos modelos aparecen descritas en Tabla 2.1 y en la Figura 2.14.

Tabla 2.1.

Características Estructurales ideales de A, B, y Z ADN

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Los factores que confieren estabilidad y funcionalidad a la molécula de ADN pueden resumirse en los siguientes aspectos:

La síntesis de proteínas involucra que se haga una copia del ADN genómico en una cadena polinucleotídica distinta, denominada ARN o ácido ribonucleico. Del mismo modo que el ADN, está compuesto por una cadena lineal de nucleótidos con dos diferencias químicas. El azúcar es una D-ribosa y la base Timina es reemplazada por Uracilo.

Las moléculas de ARN no presentan una composición definida de bases y existen como una hebra simple que puede organizarse en una estructura terciaria definida en algunos casos como veremos.Dependiendo de la función biológica, los ARN pueden presentar estructuras alargadas, doble hélices o pueden ser globulares en que algunas regiones son doble hélices conectadas por regiones lineales. Doble hélices cortas se encuentran en t-ARN, r-ARN, en los genes de cubierta proteica de bacteriófagos y en algunos m-ARN. Doble hélices más desarrolladas se encuentran en RNA de virus y en algunos polinucleótidos sintéticos. En todos los casos puede encontrarse el mismo tipo de apareamiento de bases que el que se ha descrito para el ADN.

La composición global de bases de ARN de orígenes diferentes también puede variar. Algunos ejemplos se dan en la Tabla 2.2:

Tabla 2.2. Composición de bases de RNA de orígenes diferentes

El ARN contiene toda la información del ADN de origen, así como también puede presentar el mismo apareamiento de bases. Este proceso de copia se denomina transcripción y requiere un dinamismo conformacional dependiente de las interacciones entre estos polinucleótidos con enzimas, proteínas componentes de la cromatina en algunos casos, reguladores, iones, etc. También es necesario que pueda liberarse esta copia luego de haberse formado para que el ADN pueda volver a constituirse en una doble hélice.

Este ARN se denomina mensajero(mARN), de una sola hebra y bastante más corto que el ADN, ya que cada uno sólo lleva la información para una proteína. Ya que es una molécula más pequeña que el ADN resulta mucho más soluble. Esto es necesario ya que requiere difundir hacia los ribosomas donde se realiza el milagro de la síntesis proteica. Como sabemos, los codones en el mARN no reconocen directamente los ámino ácidos; éstos tienen que ser presentados por otro tipo de ARN, el ácido ribonucleico de transferencia (tARN). Estos tARN tienen alrededor de 80 nucleótidos, son diferentes para cada ámino ácido pero presentan rasgos estructurales comunes, que pueden resumirse en la Figura 2.15

El plegamiento que se ha encontrado para la mayoría de los tRNA cuya estructura tridimensional se ha determinado por difracción de rayos X, corresponde lejanamente a una hoja de trébol, en que ciertas regiones han formado puentes hidrógeno, organizándose en estructuras helicoidales, dejando ciertas regiones un poco menos organizadas, regiones de "loops"o bucles sin puentes hidrógeno.

Estas zonas son : El extremo 3', que consta de ACC más un cuarto nucleótido variable; esta es la región a la cual se unen los ámino ácidos. Como puede observarse también existen tres asas. El asa marcada con una flecha contiene el anticodón.

Existen varias otras formas de ácidos ribonucleicos, entre ellos los ARN ribosomales (rARN), es decir ácidos ribonucleicos que se encuentran formando parte del ribosoma. El ribosoma se ha descrito como formado por dos subunidades, clasificadas así de acuerdo a su coeficiente de sedimentación, como la subunidad pequeña(conocida como 16sARN en procariotes y 18sARN en eucariotes), que contiene una sola molécula de rARN de 1600 a 1800 nucleótidos. La subunidad grande (23sARN) contiene alrededor de 2000 nucleótidos y ademas algunos fragmentos pequeños de alrededor de 120 y 160 nucleótidos (5s y 5.8s respectivamente). Esta organización es dependiente de la especie.

Las estructuras de estos ARN, parecen ser bastante conservadas, especialmente las interacciones que estabilizan los bucles, y vueltas. Se ha encontrado que se repiten las secuencias GNRA, UNCG, y CUUG (N = cualquier base) en los bucles formados por 4 nucleótidos. La Figura 2.16. muestra un diagrama esquemático de rARN de oocitos de Xenopus laevis. También en este caso la el conocimiento de la estructura permitirá aclarar la función de cada una de las subunidades ribosomales y permitirá comprender las relaciones entre proteínas y ácidos nucleicos.

Para estas moléculas se ha descrito también otras funciones como una función autocatalítica observada por primera vez en el protozoo Tetrahymena.

El producto final del mensaje genético es una proteína. Las proteínas son macromoléculas lineales, formadas por subunidades ámino acídicas enlazadas cabeza -cola para formar polipéptidos de alto peso molecular. (Para un estudio detallado sobre estructura de proteínas revisar : H.Cid, Monografía " Estructura de Proteínas" (1995)). Las unidades monoméricas son los L-ámino ácidos. La estructura de Alanina se muestra en la figura 2.17 para ejemplificar la estereoquímica de los ámino ácidos que se encuentran en las proteínas. Su estructura química se describe en la Tabla 2.3.

Los L- ámino ácidos se unen a través de enlaces peptídicos, a través de una reacción de condensación cabeza-cola con pérdida de una molécula de agua, para formar un polipéptido.

Figura 2.18. Formación del enlace peptídico.

La existencia de un enlace peptídico, covalente doble parcial entre C y N, restringe la movilidad de la cadena polipeptídica principal, a sólo rotaciones alrededor del C y de los enlaces covalentes correspondientes a las cadenas laterales de cada uno de los ámino ácidos como se observa en la Figura 2.19:

Las características especiales de cada proteína están en su mayor parte codificadas en la secuencia de ámino ácidos, que es la señal transmitida por los genes. La secuencia de los ámino ácidos en la cadena polipeptídica de una proteína se denomina Estructura primaria. Por ejemplo, la estructura primaria de R-ficocianina de Synechococcus sp. se observa en la figura 2.20:

Como ya se ha descrito, en todas las proteínas el enlace peptídico une a los ámino ácidos, conservando las características químicas de las cadenas laterales, es decir, su polaridad, tamaño y composición, y, en gran medida, cuando existen grupos ionizables, del estado de ionización de los ámino ácidos. Por ejemplo, si consideramos el ácido aspártico, su grupo carboxilo estará disociado a pH mayores que 4.0 (ver Tabla 2.3), y por lo tanto a ese pH tendrá mayores posibilidades de participar en una interacción electrostática.

Si no está disociado, sus posibilidades de formar uniones puente hidrógeno son mayores. Cuando la mitad de los carboxilos está disociada, se alcanza el equilibrio y este equilibrio está representado por los pK (-ln Keq) del grupo ionizable considerado.

Tabla 2.3.

Estructura química de los 20 amino ácidos presentes en las proteínas,

siglas más usadas y valores de pKa para sus grupos ionizables

Tabla 2.3.

Estructura química de los 20 amino ácidos presentes en las proteínas,

siglas más usadas y valores de pKa para sus grupos ionizables

Punto isoeléctrico

Se denomina punto isoeléctrico al pH en el cual una proteína, péptido o ámino ácido (AA) no migran cuando están expuestos a un campo eléctrico. También puede definirse como el pH en que la forma predominante es AAo, en que cualquiera pequeña concentración de AA+ esté balanceada por una pequeña concentración de AA-.

Sean las dos reacciones correspondientes a la disociación de un ámino ácido.

Ka1 Ka2

Ka1 = [AAo] [H+] Ka2 = [AA-] [H+]

[AA+] [AAo]

de estas ecuaciones despejamos

[AAo] = Ka1[AA+] y [H+] = Ka2[AAo]

[H+] [AA-]

[H+] = Ka1Ka2[AA+]

[H+][AA-]

[H+]2 = Ka2Ka1[AA+]

[AA-]

Si [AA+] = [AA-]

entonces

[H+] = (Ka1Ka2)1/2 o lo que es lo mismo

pH = pKa2 + pKa1

2

Es decir para un ámino ácido como alanina por ejemplo, el punto isoeléctrico corresponderá al promedio entre pKa1 y pKa2.

Este tratamiento puede ampliarse a los diferentes ámino ácidos y a las cadenas polipeptídicas considerando los grupos disociables y sus respectivos pK.

La figura representa el comportamiento de ionización de las cadenas laterales de ácido aspártico (D), ácido glutámico (E), histidina (H) Lisina (K) y arginina (R).

El comportamiento de ionización tanto de ámino ácidos libres como en cadenas polipeptídicas puede determinarse mediante las curvas de titulación de los grupos cargados. Ejemplos de este tipo de curvas se muestran en las figuras 2.22 para alanina y 2.23 para ácido glutámico, histidina y lisina:

Este comportamiento de ionización, hace que la estabilidad de las moléculas se vea afectada. Es decir, cambiando el pH del medio, la molécula considerada se acomodará a un nuevo mínimo de energía potencial que involucrará este estado de ionización (que a su vez afectará los factores electrostáticos, posibilidades de formación de puentes hidrógeno, solubilidad, etc).

Las características de cada ámino ácido, tamaño, polaridad, grado de hidrofobicidad, y la secuencia ámino acídica son elementos determinantes en la estructura tridimensional que adquiera la proteína.

A modo de ejemplo, se ha podido relacionar la presencia de ámino ácidos específicos asociados a rasgos estructurales y funcionales particulares:

Glicina

Proporciona un mínimo de impedimento estérico a la rotación y por lo tanto suele encontrarse en las vueltas en cadenas polipeptídicas.

Alanina, Valina, Leucina e Isoleucina

Participan en las interacciones hidrofóbicas que estabilizan una proteína.

Prolina

Este iminoácido contiene una amina secundaria lo que limita su flexibilidad conformacional. Tiene influencia en el plegamiento de la cadena polipeptídica.

Fenilalanina, Tirosina y Triptofano

Participan en núcleos hidrofóbicos y son capaces de estabilizar moléculas planas. Tirosina además posee un grupo funcional -OH; se le encuentra frecuentemente participando en la catálisis.

Serina y Treonina

Poseen un grupo funcional -OH, con propiedades ácidas débiles. Pueden formar ésteres con ácidos fosfóricos, es decir pueden constituir sitios de fosforilación de proteínas, y además por sus características pueden también constituir sitios de unión de azúcares en glicoproteínas (glicosilación)

Acidos Glutámico y Aspártico

Se encuentran disociados a pH neutro y proporcionan en general grupos aniónicos en la superficie de la proteína.

Asparragina y Glutamina

Son ámino ácidos polares con capacidad de interaccionar vía puentes hidrógeno.

Cisteína

Posee un grupo funcional -S-H, un ácido débil que se oxida espontáneamente en presencia de oxígeno y forma los denominados puentes disulfuro o -S-S-. Generalmente están presentes en proteínas solubles, y en gran número en aquellas sometidas a stress mecánico. Este tipo de enlace es muy importante en algunas proteínas ya que produce la estabilización de la estructura.

Metionina

Este ámino ácido se encuentra en baja cantidad en las proteínas y preferentemente se localiza en el interior de la proteína por su carácter hidrofóbico.

Histidina

Posee un grupo funcional básico capaz de aceptar un protón para formar el ácido conjugado. Se le ha encontrado formando parte del sitio activo de varias enzimas(tripsina) y en sitios de unión de metales(hemoglobina).

Lisina y Arginina

Presentan un grupo potencialmente reactivos y a pH neutro se encuentra casi siempre protonados. Arginina puede ser sitio de unión de fosfatos.

Si pudiésemos observar la cadena creciente en sus interacciones con el medio ambiente, veríamos una continua acomodación de la cadena polipeptídica, en una búsqueda de lograr un mínimo de energía. Esto implica lograr un plegamiento de la cadena polipeptídica que asegure una maximización de las interacciones para lograr una máxima estabilidad estructural y un reordenamiento del solvente para que produzca un máximo de entropía.

Estas interacciones producen finalmente la estructura de una proteína. Un modelo de la estructura de una proteína se observa en la Figura 2.24:

La Figura 2.24 muestra la dirección del plegamiento de una cadena polipeptídica y sólo se indican los Ca para simplificar la figura. La complejidad estructural de la macromoléculas, proteínas, ácidos nucleicos y polisacáridos ha dificultado el conocimiento de una información estructural detallada que permitiese entender la función de los sistemas. Los métodos en uso para el estudio estructural de las macromoléculas: Difracción de Rayos X, Resonancia Magnética Nuclear, Espectrometría de masas, polarización de fluorescencia, métodos de marcaje isotópico, y otros han debido utilizarse en conjunto para lograr obtener la información necesaria.